酸性染料比色法测定对叶百部中总生物碱含量

酸性染料比色法测定对叶百部中总生物碱含量

吴港圆1a，覃海琴1a，胡东南2，张

（1.广西中医药大学，a.药学院；b.广西壮瑶药重点实验室，南宁

淼1b，谢凤凤1b，王孝勋1a

530200；2.广西壮族自治区药用植物园，南宁

530023）

摘要：采用酸性染料比色法测定不同发育时期的对叶百部（StemonatuberosaLour.）中总生物碱含量，采用酸性染料比色法，以对叶百部碱为对照品，溴麝香草酚蓝为酸性染料，甲醇、三氯甲烷提取，4%盐酸溶解，在413nm波长下测定。结果表明，对叶百部碱的标准曲线为Y=0.0037X+0.089（R2=0.9959），在32~800μg/mL范围内线性关系良好；平均加样回收率为101.23%，平均加样回收率的RSD为2.63%。1年生色法具有操作简便、重复性好、稳定性高的优点。

关键词：对叶百部（StemonatuberosaLour.）；总生物碱；酸性染料比色法；不同发育时期中图分类号：R917

文献标识码：A

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

文章编号：0439-8114（2023）12-0154-04DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.12.028

对叶百部总生物碱含量为1.87~4.55mg/g；2年生对叶百部总生物碱含量为4.52~9.63mg/g。酸性染料比

DeterminationoftotalalkaloidinStemonatuberosaLour.byaciddyecolorimetricmethod

WUGang-yuan1a，QINHai-qin1a，HUDong-nan2，ZHANGMiao1b，XIEFeng-feng1b，WANGXiao-xun1a

（1a.CollegeofPharmacy，1b.KeyLaboratoryofZhuangYaoMedicineinGuangxi，GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530200，China；

2.GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants，Nanning530023，China）

Abstract：ThetotalalkaloidcontentinStemonatuberosaLour.atdifferentdevelopmentalstageswasdeterminedusingtheaciddyecolorimetricmethod.Theaciddyecolorimetricmethodwasused，withStemonatuberosaLour.alkaliasthereferencematerialandbro⁃mothymolblueastheaciddye.Methanolandchloroformwereextracted，anddissolvedin4%hydrochloricacid.Thedeterminationwascarriedoutatawavelengthof413nm.TheresultsshowedthatthestandardcurveofStemonatuberosaLour.alkaliwasY=0.0037X+

0.089（R2=0.9959）.Thelinearrelationshipwasgoodfrom32to800μg/mL；theaveragesamplerecoveryratewas101.23%，andthe

RSDoftheaveragesamplerecoveryratewas2.63%.ThetotalalkaloidcontentofannualStemonatuberosaLour.was1.87~4.55mg/g；thetotalalkaloidcontentofthebiennialStemonatuberosaLour.was4.52~9.63mg/g.Theaciddyecolorimetricmethodhadtheadvan⁃tagesofsimpleoperation，goodrepeatability，andhighstability.

Keywords：StemonatuberosaLour.；totalalkaloid；aciddyecolorimetricmethod；differentdevelopmentalstages

中药百部为百部科百部属植物直立百部（Ste⁃monasessilifoliaMiq.）、蔓生百部（Stemonajaponica（Bl.）Miq.）或对叶百部（StemonatuberosaLour.）的干燥块根，甘、苦，微温，归肺经，具有润肺下气止咳、杀虫灭虱的功效［1］，对叶百部是目前市场上百部类药材的主要来源［2］。对叶百部包含生物碱类和其他非生物碱类化学成分。生物碱类是百部属植物的主

要化学成分及活性成分［3］，是百部止咳和杀虫的主

5］

要活性物质［4，。百部药材中的生物碱成分在类别

和含量上有差异，直立百部和蔓生百部的化学成分基本相同，而对叶百部与直立百部、蔓生百部的化学成分差异显著［6-8］。中药材的质量评价以2020年《中华人民共和国药典（一部）》（以下简称《中国药典》）为准则，保证中药安全、有效、稳定及可控。《中

收稿日期：2022-07-11

基金项目：广西壮瑶药重点实验室基金资助项目（桂科基字［2014］32号）；广西2011协同创新中心基金资助项目（桂教科研［2013］20号）；广西

南宁市科学研究与技术开发计划基金资助项目（20193120）

作者简介：吴港圆（1997-），女（侗族），湖南通道人，在读硕士研究生，研究方向为叶百部野生及迁地栽培品种种质资源开发，（电话）158****8597

（电子信箱）*****************；通信作者，王孝勋（1973-），男，湖南常德人，研究员，博士，主要从事中药品种、质量及资源开发研究，（电话）159****1099（电子信箱）****************。

第12期吴港圆等：酸性染料比色法测定对叶百部中总生物碱含量155

国药典》中以生物碱为主要活性成分的多味中药材均以生物碱成分为评价指标，如苦参的含量测定以苦参碱和氧化苦参碱为评价指标，麻黄的含量测定以盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱为评价指标，防己的含量测定以粉防己碱和防己诺林碱为评价指标。但《中国药典》中尚未收载百部药材的含量测定方法，百部项下仅有性状、鉴别、浸出物、生物碱的理化鉴别方法等项目，其质量标准中既没有TLC定性鉴别，也没有含量测定，不能有效评价、控制百部药材和相关制剂的质量。本研究建立对叶百部中总生物碱含量的酸性染料比色测定方法，为百部（对叶百部）质量标准体系的完善提供技术参考。

1

材料、试剂与仪器

1.1

材料

对叶百部样品为2019年10月下旬至2020年1

月上旬在广西防城港市、梧州市、贺州市、桂林市、河池市、崇左市、百色市等地区采集的野生植株，经广西中医药大学滕建北教授鉴定为对叶百部。采用幼苗迁地栽培的方式种植于广西中医药大学仙葫药圃，并根据时节与实际需求进行浇水、除草、松土、引藤上架及施肥等田间管理。1年生的样品于2021年春季采挖，按照《中国药典》的方法进行净制、蒸煮、切片、烘干、打粉，过50目筛备用。2年生的样品于20221.2

年采挖，试剂和仪器

处理方式同1年生的样品。对叶百部碱（含量≥98%）购自成都普思生物科技股份有限公司；甲醇、三氯甲烷等试剂均为分析纯。UV-2600型紫外可见分光光度计购自岛津仪器（苏州）有限公司；低温旋转蒸发仪购自上海爱朗仪器有限公司；SQP型电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；BSA224S型电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PHSJ-4A型实验室pH计购自上海仪电科学仪器股份有限公司。

2

方法与结果

2.1

对叶百部总生物碱的理化鉴定

参照《中国药典》百部项下的理化鉴定方法，取

对叶百部粉末3g，加70%乙醇50mL，超声波提取4010~11min甲烷层，，，加入三氯甲烷滤过，滤液蒸去乙醇，低温旋蒸，蒸干，4mL残渣加，振摇提取残渣加氨水调节1%盐酸溶液3次，分取三氯pH至5mL，

溶解，滤过。滤液分为2份：一份滴加碘化铋钾试液；另一份滴加硅钨酸试液。1年生的11个样品及2年生的10个样品均表现为碘化铋钾显色反应有橙红色沉淀生成，硅钨酸显色反应有乳白色沉淀生成。

2.2溶液制备

精密称取对叶百部碱10.0mg，置于50mL容量

瓶中，用甲醇稀释并定容，即得0.2mg/mL对叶百部碱对照品溶液。称取溴甲酚绿粉末0.1g，加2.8mL0.05超声波提取mol/L氢氧化钠溶液，15min，即得溴甲酚绿溶液。称取溴麝再加去离子水稀释至200mL，香草酚蓝粉末0.1g，加3.2mL0.05mol/L氢氧化钠溶液，再加去离子水稀释至200mL，超声波提取15min末（过，即得溴麝香草酚蓝溶液。精密称取对叶百部粉50目筛）1.0000g，加40mL甲醇，超声波提取20用4%min盐酸溶解，。放置室温，抽滤。滤液用氨水调节滤过，得到醇提液。挥干甲醇，pH至9~10烷萃取，，沉淀和滤液均转移至分液漏斗中，分取三氯甲烷层，低温旋蒸，蒸干三氯甲烷。

20mL三氯甲甲醇溶解，定容：1年生的样品定容至25mL；2年生的样品定容至50mL，即得供试品溶液。2.3

测定波长和酸性染料的种类及用量选择取1mL供试品溶液2份，分别置于60mL分液漏斗中，一份中加入7mLpH5.4乙酸-乙酸钠缓冲液、3mL溴甲酚绿溶液，4mL三氯甲烷萃取，振摇5定容至min，静置10mL30，min全波长扫描；，分取三氯甲烷层，另一份加入重复萃取7mLpH3次，5.4乙酸-乙酸钠缓冲液、3mL溴麝香草酚蓝溶液，4mL三氯甲烷萃取，振摇5min，静置30min，分取三氯甲烷层，重复萃取3次，定容至10mL，全波长扫描。同法取1mL对照品溶液2份，分别加溴甲酚绿溶液、溴麝香草酚蓝溶液进行全波长扫描。同法取1mL三氯甲烷制备空白对照。由图1可知，供试品溶液、对照品溶液在采用溴甲酚绿溶液、溴麝香草酚蓝溶液作为酸性染料时，均在413nm波长处吸光度（A）最大，且A溴麝香草酚蓝>A溴甲酚绿，故确定测定波长为413nm，酸性染料为溴麝香草酚蓝，溴麝香草酚蓝酸性染料用量分别为3、4、5、6mL。考察溴麝香草酚蓝酸性染料用量对紫外吸收的影响，结果表明，A>A5mL>A6mLA>4mL3mL，故确定酸性染料溴麝香草酚蓝的用量为52.4

mL。缓冲液类型、pH及用量的选择

以5mL溴麝香草酚蓝为酸性染料，分别考察了邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液和乙酸-乙酸钠缓冲液对供试品溶液及对照品溶液的紫外吸收影响，结果表明，A乙酸-乙酸钠缓冲液>A邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液，故确定缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。以乙酸-乙酸钠为缓冲液，5mL溴麝香草酚蓝为酸性染料，乙酸-乙酸钠缓冲液pH分别为4.2、4.6、5.0、5.4。考察乙酸-乙酸钠缓冲液pH对紫外吸收的影响，结果表明ApH5.0＞ApH5.4＞ApH4.2＞ApH4.6，故确定乙酸-乙酸钠缓冲液pH

156

湖北农2.581

度光a吸1.177

bcd

-0.227

200

波长500//nm

800

ac为含溴麝香草酚蓝的供试品溶液；为含溴麝香草酚蓝的对照品溶液；bd为含溴甲酚绿的供试品溶液；为含溴甲酚绿的对照品溶液

图1不同酸性染料处理后供试品及对照品的

全波长吸收图谱

为5.0。考察缓冲液用量分别为5、6、7、8、9mL时对紫外吸收的影响，结果表明，A8mLA-乙酸钠缓冲液的用量为>A7mL>A6mL8mL>A9mL。>2.5

5mL，故确定乙酸试剂加入顺序的选择

以8mLpH5.0乙酸-乙酸钠为缓冲液，5mL溴麝香草酚蓝为酸性染料，试剂加入顺序分别为供试品-缓冲液-酸性染料-三氯甲烷、供试品-酸性染料-缓冲液-三氯甲烷、缓冲液-供试品-酸性染料-三氯甲烷、缓冲液-酸性染料-供试品-三氯甲烷、酸性染料-缓冲液-供试品-三氯甲烷和酸性染料-供试品-缓冲液-三氯甲烷。考察试剂加入顺序对紫外吸收的影响，结果表明，A>A缓冲液-酸性染料-供试品-三氯甲烷A>酸性染料-缓冲液-供试品-三氯甲烷A>缓冲液-供试品-A酸性染料-供试品-缓冲液-三氯甲烷酸性染料-三氯甲烷

>

供试品-酸性染料-缓冲液-三氯甲烷

A>

供试品-缓冲液-酸性染料-三氯甲烷，故确定试剂加入顺序为缓冲液-酸性染料-供试品-三氯甲烷。2.6

三氯甲烷萃取次数的选择

分别考察三氯甲烷（每次4mL）萃取1、2、3、4次后是否还有紫外吸收，结果表明萃取1次及2次后的溶液紫外吸收明显且A1次溶液基本无紫外吸收且二者紫外吸收无明显差别，

>A2次，萃取3次及4次后的故确定三氯甲烷萃取次数为4次，定容至15mL。2.7

测定方法的确定

取60mL分液漏斗，依次加入8mLpH5.0乙酸-乙酸钠缓冲液、5mL溴麝香草酚蓝酸性染料、130mL待测溶液和4mL三氯甲烷，振摇5min，静置15minmL，，混匀。分取三氯甲烷层，413nm波长下测定吸光度。取三氯甲烷萃取4次，定容至三氯甲烷进行同法操作，制备空白对照。

1mL

业科学2023年

2.8线性关系的考察

分别配制32、80、160、320、400、800μg/mL的对

叶百部碱对照品溶液，按照“2.7”方法在413nm波长处测定吸光度。以对叶百部碱对照品溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程

为Y=0.0037X+0.089（R2μg/mL时对叶百部碱对照品溶液浓度与吸

=0.9959），在线性范围为光度呈良好的线性关系。32~8002.9

精密度、重复性、稳定性及加样回收率的考察精密量取1mL对叶百部碱对照品溶液，按照2.7”方法重复测定6次，吸光度的相对标准偏差RSD）为0.21%，表明仪器的精密度良好。分别精密称取6份对叶百部粉末样品，每份1.0000g，按照2.2”方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.7”方法操作，同时制备相应空白，测定吸光度，样品中总生物碱的平均含量为2.29mg/g，RSD为1.94%，表明该方法的重复性良好。精密称取1份对叶百部粉末样品1.0000g，按照“2.2”方法制备供试品溶液，按照2.7”方法每隔1h测定其吸光度，连续测定6次，吸光度的RSD为2.31%，表明溶液在5h内稳定性良好。取6份已知含量的对叶百部样品溶液25mL，加入对叶百部碱对照品溶液，配成50mL加标溶液。按照“2.7”方法操作，同时制备相应空白溶液，测定吸光度，平均加样回收率为101.23%，平均加样回收率的RSD为2.63%，表明该方法的回收率良好。

3对叶百部样品总生物碱含量的测定

分别取1年生和2年生的对叶百部11批和10批

样品粉末，各平行制备3份，每份1.0000g，精密量取。按照“2.2”方法制备供试品溶液，按照“2.7”方法操作，在413nm波长处分别测定吸光度，测定不同发育时期对叶百部样品的吸光度，取平均值，带入标准曲线计算总生物碱含量，如表1所示。1年生对叶百部总生物碱含量为1.87~4.55mg/g；2年生对叶百部总生物碱含量为4.52~9.63mg/g。

4小结与讨论

百部药材及其浸膏总生物碱含量常见的测定方

法有酸性染料比色法［9-11］、响应面分析法［12］等，其中酸性染料比色法在其他中药材总生物碱含量测定上也有应用，具有操作简便、重复性好、稳定性高的优点［13-15］。对叶百部中生物碱成分丰富，主要包括对叶百部碱、新对叶百部碱、金刚大碱、百部新碱等［16］，广西对叶百部的主要生物碱成分为百部新碱，其次为对叶百部碱和金刚大碱，新对叶百部碱较少见［17］。对叶百部生物碱成分有差异，选择单一成

“（““第12期吴港圆等：酸性染料比色法测定对叶百部中总生物碱含量

表1

对叶百部的样品信息及总生物碱含量

经纬度E108°00′，N21°37′E108°11′，N21°47′E111°37′，N23°51′E111°40′，N24°01′E110°49′，N24°49′E110°19′，N25°04′E107°16′，N25°02′E106°55′，N22°16′E106°57′，N22°37′E105°43′，N24°16′E105°35′，N24°36′海拔//m22.24163.82184.15169.22483.39164.57217.691116.32477.8063.0570.00

总生物碱含量//mg/g1年生4.062.192.712.961.873.633.144.142.482.304.55157

编号1234567810119

母株采集地防城港市东兴市防城港市防城港区梧州市苍梧县贺州市八步区桂林市恭城瑶族自治县

桂林市雁山区河池市天峨县崇左市龙州县崇左市大新县百色市田林县百色市隆林县

2年生6.19—4.524.946.739.636.619.416.027.625.58注：“—”为迁地栽培后植株生长发育不佳放弃测定

分作为含量测定标准存在一定误差，生物碱作为对叶百部的主要活性成分，以总生物碱成分作为含量测定的标准具有一定的合理性及可行性。

采用酸性染料比色法测定不同发育时期对叶百部的总生物碱含量，考察已报导的酸性染料比色法后，优化了测定条件。本研究对常用酸性染料溴麝香草酚蓝和溴甲酚绿进行比较分析，发现对叶百部待测样品及其对照品经酸性染料溴麝香草酚蓝染色后得到的有色溶液在413nm处吸光度最大，故选择溴麝香草酚蓝为酸性染料，413nm为测定波长。为了避免酸性染料因未完全溶解而影响试验结果，需对酸性染料进行15min的超声波处理。此外，酸性染料比色法的影响因素还有缓冲液的种类、缓冲液的pH及用量、酸性染料用量、试剂加入顺序以及三氯甲烷萃取次数等。三氯甲烷萃取第3次时已基本无紫外吸收，但定容时为了避免测定结果因萃取不完全而导致误差，应多萃取1次并以此次进行定容，故选择三氯甲烷萃取4次，定容至15mL。方法考察及测定时空白对照溶液的制备需按照待测液进行同法操作。本研究进行了精密度、重复性、稳定性及加样回收率的考察，结果表明，酸性染料比色法精密度较好，系统误差在允许范围之内，测试结果准确度较高，可靠性较强。

参考文献：

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医

药科技出版社，2020.

［2］冯天龙，黄灵芳，许翔鸿，等.对叶百部药材中四种主要生物碱的

分布规律［J］.中国野生植物资源，2018，37（3）：42-47.［3］岳

勇.对叶百部化学成分的研究［D］.北京：北京协和医学院，2013.

nae）［J］.Advancesinbotanicalresearch，2012，62：1-33．［5］TANGCP，CHENT，VELTENR，etal.Alkaloidsfromstemsand

leavesofStemonajaponicaandtheirinsecticidalactivities［J］.Jour⁃［6］LISL，JIANGRW，HONPM，etal.QualityevaluationofStemonae

radixthroughsimultaneousquantificationofbioactivealkaloidsbyhigh-performanceliquidchromatographycoupledwithdiodearray2007，21（10）：1088-1094.

andevaporativelightscatteringdetector［J］.Biomedchromatogr，［7］ZHOUY，JIANGRW，HONPM，etal.AnalysesofStemonaalka⁃

loidsinStemonatuberosabyliquidchromatography/tandemmassspectrometry［J］.Rapidcommunmassspectrom，2006，20（6）：［8］FANLL，XUF，HUJP，etal.Binarychromatographicfingerprint

analysisofStemonaeradixfromthreestemonaplantsanditsappli⁃［9］梁

cations［J］.Journalofnaturalmedicines，2015，69（3）：402-410.

丹，朱

华，周

碱的含量测定［J］.大众科技，2014（7）：120-121，135.［10］徐玲玲，王［11］樊兰兰，李

凌.酸性染料比色法测定百部养肺膏中总生物碱丽，张秋玲，等.酸性染料比色法测定百部流浸膏

的含量［J］.上海医药，2008，29（7）：326-327.

中的总生物碱［J］.华西药学杂志，2019，34（6）：627-631.［12］赵卫星，孙治强，高玉红，等.响应面法优化百部总生物碱提取

工艺的研究［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2008（7）：［13］余

185-190.

佳，高欣悦，付凤萍，等.半仿生-比色法测定三黄泻心汤中

峰，等.桂北产对叶百部药材鉴别及总生物

1030-1038.

nalofnaturalproducts，2008，71（1）：112-116.

总生物碱的溶出量［J］.湖北农业科学，2022，61（3）：140-143.［14］赵清梅，余永涛.酸性染料比色法测定苦马豆中总生物碱含

量［J］.湖北农业科学，2015，54（7）：1710-1712，1716.［15］严

敏，王玉凤，汤洪敏.黔产艾纳香生物碱的提取及含量测定［J］.湖北农业科学，2014，53（10）：2336-2339.

［16］姜登钊，吴家忠，刘红兵，等.百部药材的生物碱类成分及生物

活性研究进展［J］.安徽农业科学，2011，39（31）：19097-19099，［17］廖静妮，覃山丁，屈啸声，等.广西不同产地对叶百部4种生物

碱含量测定及止咳活性比较［J］.中药材，2014，37（11）：1956-1960.19102.

［4］BUTPH，SHAWPC，LINGE，etal.Chapter1-Authentication

andqualityassessmentoftheantitussiveherbBaibu（Radixstemo⁃